Джастин Тимберлейк родился в Мемфисе, Теннесси, в семье Линн Харлэсс (англ. Lynn Harless) и Рэндалла Тимберлейка (англ. Randall Timberlake), Джастин имеет английские и индейские корни. Его дед со стороны отца Чарлз Л. Тимберлейк (англ. Charles L. Timberlake), муж Бобби Джойс (англ. Bobbye Joice), был баптистским священником, и Джастин был воспитан в традициях баптистской веры, считая себя хоть и христианином, но скорее «духовным, чем религиозным». Его родители развелись в 1985 году, затем оба нашли новых супругов. Его мать, которая сейчас руководит развлекательной компанией Just-in Time Entertainment, вышла замуж за банкира Пола Харлэсса (англ. Paul Harless), когда Джастину было 5 лет. В это время его отец, дирижер хора в баптистской церкви, также женился, и его вторая жена Лиза (англ. Lisa) родила двух сыновей: Джонатана (англ. Jonathan) (1993) и Стивена (англ. Stephen) (1998). Сводная сестра Джастина Лора (Laura) умерла в младенчестве, о чем в своем признании он упомянул как «My Angel in Heaven» (Мой ангел на небесах). 

Первые шаги в музыкальной карьере Джастин сделал на телевизионном шоу «Star Search», исполняя песни в стиле кантри под именем «Justin Randall». 

Его кумирами с детства были Эл Грин и Майкл Джексон, танцевальным движениям которого он подражал. По иронии судьбы, его первый сольный альбом был в значительной степени составлен из материала, от записи которого отказался Джексон. Еще одним кумиром юного Джастина был Элтон Джон. Впоследствии Тимберлейк изобразил молодого Элтона в клипе на его песню «This Train Don’t Stop Here Anymore». 

С 1993 года Джастин выступал в детском шоу «Клуб Микки Мауса», где познакомился с будущим партнером по группе вокалистом Джошуа Чейсезом, а также с Кристиной Агилерой и со своей будущей подружкой — Бритни Спирс. Когда в 1995 году шоу закончилось, Джастин пригласил Чейсеза в новую музыкальную группу, которая вскоре прославилась как 'N Sync. 

В 2002 году Джастин покидает группу и начинает выступать как самостоятельный артист.